Rola inhibitora plazminogenu-aktywatora typu 1 w patogenezie i wyniku hemolitycznego zespołu mocznicowego

Zespół hemolityczno-mocznicowy jest ważną przyczyną ostrej i często krańcowej niewydolności nerek u dzieci.1 Choroba charakteryzuje się kłębuszkowym odkładaniem fibryny. Wewnętrzny mechanizm kłębuszkowego fibrynolizy za pośrednictwem tkankowego aktywatora plazminogenu i urokinazy może odgrywać rolę w usuwaniu takich złogów.2 W 1982 roku opisaliśmy inhibitor fibrynoli kłębuszkowej znaleziony w osoczu 17 dzieci z zespołem hemolityczno-mocznicowym.3 Chociaż brak korelacji stwierdzono pomiędzy mianem inhibitora a hematokrytem, liczbą białych krwinek i płytek krwi, stężeniami kreatyniny w surowicy lub poziomem antiplasminy, istniała bliska korelacja między poziomami inhibitora i przebiegiem klinicznym. Usunięcie inhibitora z osocza za pomocą dializy otrzewnowej było związane z poprawą czynności nerek. Chociaż nasze badania nie ujawniły dokładnej natury inhibitora, różniły się od znanych fizjologicznie ważnych inhibitorów plazmin (alfa2-antyplazminina, inhibitor esterazy C1, alfa2-makroglobulina i alfa1-antytrypsyna). Sugerowało to, że inhibicja może być skierowana przeciwko aktywatorom plazminogenu.
Spośród czterech ostatnio opisanych inhibitorów aktywatora plazminogenu, 4 inhibitor plazminogenu-aktywatora typu (PAI-1), główny inhibitor zarówno tkankowego aktywatora plazminogenu, jak i urokinazy w osoczu, wydaje się być najbardziej prawdopodobnym kandydatem na inhibitor. Zidentyfikowaliśmy inhibitor jako PAI-1, mierzyliśmy poziomy PAI-1 w osoczu od pacjentów z zespołem hemolityczno-mocznicowym i skorelowaliśmy wyniki z wynikami choroby.
Metody
Materiały
Fibrynogen bydlęcy otrzymano z Miles Laboratories (Elkhart, Ind.); [125I] jodek sodu z Amersham (Arlington Heights, Illinois); Triton X-100, Tween 80 i chlorowodorek guanidyny z Sigma Chemical (St. Louis); concanavalin A Sepharose z Pharmacia (Piscataway, NJ); 24-studzienkowe płytki z polistyrenowej płytki do hodowli tkanek od Costar (Cambridge, Massachusetts); i poliklonalne kozie antyludzkie PAI-1 z American Diagnostica (New York).
Metody analityczne
Osocze otrzymano przez umieszczenie 4 ml krwi w probówce zawierającej 6 mg EDTA i odwirowanie przy 1000 xg przez 10 minut. Inhibitor w osoczu został pierwotnie wykryty przez pomiar miana hamującego lizę za pomocą zmodyfikowanego testu zwojowego fibryny.3 Aby kwantyfikować aktywność inhibitora aktywatora plazminogenu, inkubowano 0,1 ml osocza z 0,04 jm tkankowego aktywatora plazminogenu (przygotowanego jak opisano w innym miejscu2) w 0,5 ml 0,2M buforu fosforanowego, pH 7,4, w 37 ° C przez jedną godzinę i pozostawiono na noc w 4 ° C. Pewne próbki zakwaszono do pH 3,0 za pomocą 1N kwasu chlorowodorowego, a następnie zobojętniono do pH 7,0 1N wodorotlenkiem sodu. Mieszaninę odwirowano przy 5000 x g przez 30 minut w 4 ° C. Aktywność resztkową aktywatora tkankowego plazminogenu określono w 0,5 ml supernatantu z oznaczeniem fibrynowym znakowanym 125I.2 Wyniki wyrażono jako procent hamowania (redukcji) zliczeń uwalnianych przez 0,04 jm tkankowego aktywatora plazminogenu w fosforanach- buforowana sól fizjologiczna. Stężenie antygenu PAI-1 w osoczu mierzono za pomocą specyficznego testu immunoenzymatycznego z mysim monoklonalnym przeciwciałem (ELISA) (American Diagnostica).
Inhibitor scharakteryzowano na podstawie 5 ml plazmy na podstawie chromatografii Sepharavalin A Sepharose.7 1-ml kolumnę eluowano 0,5 M alfa-metylo-D-mannozydu; Frakcje 0,5 ml analizowano pod kątem aktywności inhibitora plazminogenu-aktywatora (oznaczeniem fibryny znakowanej 125I), stężenia PAI-1 (za pomocą testu ELISA) i stężenia białka.
Wpływ denaturacji na aktywność inhibitora badano w próbkach osocza od ośmiu losowo wybranych pacjentów po ekspozycji na chlorowodorek guanidyny.8 Aktywność inhibitora mierzono testem fibrynowym znakowanym 125I.
Osocze (0,1 ml) od pięciu losowo wybranych pacjentów z zespołem hemolityczno-mocznicowym i dwójką prawidłowych dzieci inkubowano z 0,2 ml poliklonalnej surowicy koziego anty-ludzką PAI-1 lub solą fizjologiczną buforowaną fosforanem przez jedną godzinę w 37 ° C i przez noc w 4 ° C. do
[więcej w: makrocytoza, hipokrates gorzów, ośrodek uzależnień warszawa ]