Mutacje RAS w raku płaskonabłonkowym u pacjentów leczonych inhibitorami BRAF AD 4

Aby przeanalizować podstawowy mechanizm, porównaliśmy profile ekspresji genów komórek B9 przed i po ekspozycji na wemurafenib (dwa niezależne replikaty) lub PLX4720. Ocena obejmująca łącznie 306 sond genowych (reprezentujących 250 genów) sugerowała wspólną tendencję w indukowanych przez leczenie zmianach w ekspresji genów, które obejmowały dobrze scharakteryzowane geny szlaków MAPK (Spry2, Dusp6, Fos, Fos11 i Egr1) (P <0,001 przez test z trzech zestawów danych) (ryc. 3A w dodatkowym dodatku). Nadzorowana analiza tych zmian w komórkach B9 eksponowanych na wemurafenib i PLX4720 ujawniła zmianę o czynnik dwa w dziewięciu mysich homologach genów, które ulegały ekspresji różnicowej, gdy BRAF był hamowany w ludzkich komórkach czerniaka wyrażających mutację BRAF V600E (P <0,001 przez z-test) .7 Z powodu różnych linii komórkowych w tych dwóch badaniach, to zachodzenie jest znaczące (P <0,001 według analizy chi-kwadrat z korektą Yatesa, test dwustronny). W przypadku tych dziewięciu genów zmiana w komórkach B9 była przeciwieństwem zmiany w sygnaturze genu obserwowanej w komórkach czerniaka BRAF V600E człowieka (Figura 3B) (patrz Figura 3B w Dodatku Aneks do potwierdzenia za pomocą odwrotnej transkryptazy Test PCR), co sugeruje, że proliferacja stymulowana przez inhibitor BRAF wynika z paradoksalnie zwiększonego wpływu transkrypcji szlaku MAPK w komórkach ze zmutowanym HRAS. W celu dokładniejszego zbadania funkcjonalnej roli najbardziej rozpowszechnionej mutacji, HRAS Q61L ulegał ekspresji w linii komórkowej ludzkiego raka płaskonabłonkowego A431, która już zawiera zamplifikowany EGFR, ale ma RAS typu dzikiego. Ekspozycja na wemurafenib indukowała niewielką proliferację w komórkach A431 transfekowanych kontrolnym wektorem plazmidowym. W komórkach A431 eksprymujących HRAS Q61L przy użyciu transfekcji plazmidem, do 3 ?M werulafenibu stymulowało proliferację komórek, podczas gdy wyższe stężenia zmniejszały proliferację (Fig. 4A i 4B w Dodatku Uzupełniającym). Podobne dane uzyskano przy ekspresji HRAS Q61L w komórkach A431 z użyciem transdukcji lentiwirusowej (ryc. 4C w dodatku uzupełniającym). Analiza Western blot wykazała zależny od dawki wzrost pERK, który był najbardziej zauważalny po 24 godzinach, z minimalnym wpływem na szlak sygnalizacji równoległej 3-kinazy fosfatydyloinozytolu (PI3K) -AKT (Fig. 5A w Dodatku Uzupełniającym).
Ponieważ amplifikacja EGFR w komórkach A431 może zakłócać działanie wemurafenibu na komórki wyrażające onkogenny HRAS, badaliśmy interakcję pomiędzy HRAS Q61L i wemurafenibem w komórkach NIH3T3, unieśmiertelnioną linią komórek fibroblastów z dzikim RAS i bez amplifikacji EGFR. Komórki transfekowane za pomocą wektora kontrolnego nie tworzyły kolonii; gdy komórki transfekowano HRAS Q61L, wielkość kolonii wzrastała w sposób zależny od dawki (Fig. 5B w dodatkowym dodatku), ze wzrostem pERK, po ekspozycji na wemurafenib (Figura 3C).
Te trzy modele in vitro pokazują, że wemurafenib stymuluje proliferację w komórkach ze zmutowanym HRAS Q61L przez paradoksalną aktywację szlaku MAPK, o czym świadczy zwiększona fosforylacja ERK i zwiększona ekspresja genów regulowanych przez ERK.
PLX4720 i zmniejszone opóźnienie nowotworu w mysim modelu karcinogenezy skóry
Aby modelować in vivo skutki hamowania BRAF w raku skóry płaskonabłonkowej i rogowiaka kolczystokomórkowego, wykorzystaliśmy model dwustopniowego karcynogenezy skóry, w którym miejscowe zastosowanie karcinogenu 7,12-dimetylobenzo- (a) antracenu (DMBA) indukuje HRAS Mutacje Q61L w keratynocytach myszy.17 Późniejsze zastosowanie promotora nowotworu 12-O-tetradekanoilo-13-octanu (TPA) indukuje następnie te zmiany17.
Ryc. 4. Ryc. 4. Przyspieszenie wzrostu guzów skórnych typu niezwłaskowego u myszy z zahamowaniem BRAF. Panel A pokazuje liczbę namacalnych guzów pojawiających się w czasie u myszy leczonych czynnikiem rakotwórczym 7,12-dimetylobenz (a) antracen (DMBA), promotor nowotworu 12-O-tetradekanoiloforbol-13-octan (TPA), inhibitor BRAF PLX4720 (PLX) (25 mg na kilogram masy ciała na dzień) i inhibitor MEK PD184352 (PD) (25 mg na kilogram dziennie). Każda kohorta składała się z sześciu myszy i pokazano średnią liczbę guzów na mysz. I słupki reprezentują odchylenia standardowe. Panel B pokazuje wyniki po 90 dniach po traktowaniu myszy czterema różnymi schematami.
U myszy, które otrzymały DMBA i TPA razem z PLX4720, pojawienie się tych zmian było znacznie przyspieszone, w porównaniu z myszami, którym podano sam DMBA i TPA (Figura 4). Dodanie PLX4720 nie zwiększyło liczby uszkodzeń indukowanych przez DMBA i TPA, ale zmniejszyło opóźnienie guza o 45% i zmniejszyło odstęp pomiędzy początkowym rozwojem zmian a maksymalnym obciążeniem nowotworem o 35% (P = 0,002 według Kruskala). – Test Wallisa)
[hasła pokrewne: dermatologa, stomatologia Kraków, ginekologia ]
[patrz też: makrocytoza, terapia psychologiczna warszawa, molsidomina ]