Mutacje RAS w raku płaskonabłonkowym u pacjentów leczonych inhibitorami BRAF AD 2

Pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę na analizy molekularne zmian nowotworowych skóry wyciętych podczas badań dermatologicznych podczas ich badania. Analizy molekularne próbek nowotworowych
DNA wyekstrahowany z próbek nowotworu zsekwencjonowano dla HRAS (eksony i 2), NRAS (eksony i 2), KRAS (eksony i 2) i CDKN2A (ekson 2) z użyciem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR ) amplifikacja. (W przypadku starterów, patrz Tabela i Tabela 2 w Dodatku Aneks, dostępne wraz z pełnym tekstem tego artykułu na stronie.) Następnie zastosowano sekwencjonowanie Sanger23 (patrz sekcja Metody w dodatkowym dodatku). Substytucje lub delecje pojedynczej zasady w eksonach TP53 od 2 do 11 analizowano przy użyciu badanego testu AmpliChip p53 (Roche Molecular Systems), zgodnie z instrukcjami producenta. Fosforylację ERK oceniano za pomocą analizy immunohistochemicznej.
Komórkowe analizy interakcji między zmutowanymi HRAS i inhibitorami BRAF
Zmutowaną linię komórkową raka płaskonabłonkowego raka myszy B9 mutanta HRAS zaszczepiono na miękkim agarze z wemurafenibem, z analogicznym związkiem narzdziowym PLX4720 (oba z Plexxikon) lub z kontrolnym nośnikiem dimetylosulfotlenku (Sigma-Aldrich), dla badań niezależnych od zakotwiczenia. wzrost klonalny, jak opisano poprzednio. Komórki ludzkiego płaskonabłonkowego raka płaskiego A431 (ATCC) transfekowano pustym wektorem lub plazmidem niosącym HRAS Q61L z użyciem Fugene 6 (Roche Molecular Systems), zgodnie z instrukcjami producenta, lub stabilnie transdukowane kontrolnym lub lentiwirusowym wektorem HRAS Q61L, jak opisano wcześniej.24 Komórki analizowano pod kątem proliferacji po ekspozycji na wemurafenib za pomocą zliczeń żywotności komórek lub testów MTT lub MTS, jak opisano poprzednio.9,11,25 komórek NIH3T3 (ATCC ) transfekowano pustym wektorem lub plazmidem H61S Q61L z użyciem Fugenu 6 i analizowano pod kątem tworzenia kolonii w miękkim agarze. 11 [0124] Przeprowadzono analizę Western blot, jak opisano wcześniej. 1,25 Przeprowadzono co najmniej dwa niezależne doświadczenia w trzech powtórzeniach z użyciem każdego modelu.
Analiza ekspresji genów
Komórki B9 wysiano w kontrolnym dimetylosulfotlenku lub uM wemurafenibu lub PLX4720 i inkubowano przez 16 godzin. Komórki zebrano, wyizolowano całkowity RNA (RNeasy Mini Kit, Qiagen), a ekspresję genu zmierzono przy użyciu układów macierzy Affymetrix Mouse 420 2,0, zgodnie z instrukcjami producenta. Gen odpowiedzi Vemurafenib i PLX4720 zidentyfikowano jako te, które zmieniły się o czynnik większy niż 2 (zwiększony) lub mniejszy niż 0,5 (regulowany w dół) w stosunku do kontroli. Wzory genów komórek B9 porównywano z genami wyjściowymi szlaku MAPK z pięciu ludzkich linii komórek czerniaka, 7 i różnicową ekspresję genów potwierdzono za pomocą testu PCR.
Badania na myszach
Procedury na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z lokalnymi komitetami ds. Etyki zwierzęcej. Dwustopniowe procedury karcynogenezy skóry były zasadniczo tymi, które opisano wcześniej, 16,26 z sześcioma zwierzętami na grupę. Inhibitor BRAF PLX4720 i inhibitor MEK PD184352 zsyntetyzowano w Instytucie Badań nad Rakiem i dostarczono za pomocą zgłębnika doustnego (25 mg na kilogram masy ciała na dzień) w 200 ?l dimetylosulfotlenku w wodzie (roztwór 1:19).
Przestudiuj badanie
Dane wygenerowane i zebrane przez badaczy zostały przeanalizowane przez starszych autorów akademickich i branżowych, którzy gwarantują kompletność i dokładność analiz oraz raportowane wyniki. Protokoły protokołów klinicznych dla czterech badań są dostępne pod adresem.
Analiza statystyczna
Wyniki testu mutacji w początkowych 21 okazach skórnych zmian raka płaskonabłonkowego podtypu keratoadenoma oraz w 14 niezależnych próbach walidacyjnych przedstawiono jako częstotliwości mutacji z 95% przedziałami ufności. Analizę statystyczną profilowania ekspresji genów przeprowadzono za pomocą testu z-Z i analizy chi-kwadrat z poprawką Yatesa. Analizę eksperymentów z hodowlą linii komórkowej przeprowadzono za pomocą testu t Studenta i dwukierunkowej analizy wariancji z analizą post-testu Bonferroni. W badaniach myszy przeprowadzono analizę wariancji za pomocą testu Kruskala-Wallisa.
Wyniki
Charakterystyka pacjentów i uszkodzeń
Rycina 1. Ryciny 1. Raki skóry płaskonabłonkowej lub keratoakantoma u pacjentów leczonych wemurafenibem. Przedstawiono zdjęcia reprezentatywne i fotomikrografie nieczerczastych zmian skórnych u pacjentów leczonych wemurafenibem. Górny obraz na panelu A pokazuje zmianę z klinicznymi cechami rogowiaka kolczystokomórkowego, odnotowaną w 98 dniu po rozpoczęciu stosowania wemurafenibu w dawce 960 mg dwa razy na dobę, w centralnie analizowanej serii początkowej.
[przypisy: badanie kardiologiczne, stomatologia dziecięca, Warszawa ginekolog ]
[podobne: gabinet psychoterapii kraków, histigen, kraniektomia ]